Новости

Mar 23, 2024

CRISPR/Cas12a в сочетании с RPA для обнаружения T. gondii в цельной крови мышей

Паразиты и векторы, том 16, номер статьи: 256 (2023) Цитировать эту статью 280 Доступов 1 Подробности Altmetric Metrics Toxoplasma gondii — условно-патогенное простейшее, повсеместно распространенное у людей и

Паразиты и переносчики, том 16, Артикульный номер: 256 (2023) Цитировать эту статью

280 доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Toxoplasma gondii — условно-патогенное простейшее, повсеместно распространенное у людей и животных. Он может проникнуть в любой орган человека и вызвать тяжелые заболевания, включая токсоплазменную офтальмопатию, менингоэнцефалит и некроз печени. В Китае распространен токсоплазмоз свиней. Системы CRISPR (кластерные регулярные короткие палиндромные повторы) и Cas (CRISPR-ассоциированный белок) широко используются для редактирования генов и обнаружения патогенов. Диагностика на основе CRISPR — это молекулярные анализы, разработанные для обнаружения паразитов с высокой чувствительностью и специфичностью.

Это исследование было направлено на создание комбинированного метода быстрого обнаружения CRISPR/Cas12a и RPA для T. gondii путем нацеливания на ген B1 и повторяющийся элемент длиной 529 п.о. (529 RE). Результаты обнаружения можно визуализировать с помощью флуоресценции или полосок бокового потока (LFS). Оценивали чувствительность и специфичность метода, для обнаружения использовали кровь мышей, инфицированных T. gondii.

Результаты показали, что установленный метод обнаружения T. gondii был удовлетворительным с пределом обнаружения 1,5 сП/мкл для двух локусов. Более того, ген B1 мог обнаруживать 1 тахизоит на реакцию, а 529 RE мог обнаруживать 0,1 тахизоита на реакцию, что соответствует высокочувствительным результатам гнездовой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод был пригоден для штаммов, включая RH, и не вступал в перекрестную реакцию с ДНК других простейших со схожими привычками. Все образцы крови мышей, инфицированных T. gondii, были положительными на T. gondii через 1, 3 и 5 дней после заражения (dpi).

В результате этого исследования был создан быстрый, чувствительный и экономящий время метод обнаружения ДНК T. gondii, который потенциально может стать альтернативным инструментом для обнаружения T. gondii в полевых условиях.

Токсоплазмоз — заболевание человека и животных, вызываемое специализированным внутриклеточным паразитом Toxoplasma gondii, распространенное по всему миру [1]. Toxoplasma gondii gondii может инфицировать всех теплокровных животных, включая человека [2]. У иммунокомпетентных лиц инфекция T. gondii может вызывать гриппоподобные симптомы, которые сохраняются в течение недель или месяцев, прежде чем исчезнут. Однако люди с ослабленным иммунитетом, например, люди с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), пожилые люди и те, кто принимает иммунодепрессанты, подвергаются более высокому риску тяжелого заболевания и даже смерти после заражения T. gondii [3]. Беременные женщины, инфицированные T. gondii, также подвергаются риску врожденного токсоплазмоза у плода, что может привести к ряду неблагоприятных исходов, таких как аборт, пороки развития или мертворождение [4]. Сообщается, что серологически положительный уровень T. gondii у людей в некоторых регионах Китая достигает 23,41%, что указывает на широкое распространение инфекции в стране [5]. Помимо воздействия на здоровье человека, T. gondii оказывает значительное влияние на животноводство: исследования показывают, что глобальная серологическая распространенность T. gondii у свиней составляет 19% [6]. Инфекция T. gondii у свиней может проявляться рядом симптомов, включая отсутствие лихорадки, диарею, отек легких и аборты у свиноматок. Учитывая, что свинина является основным источником мяса для человека, токсоплазмоз свиней увеличивает вероятность заражения человека T. gondii. Профилактика и скрининг T. gondii становятся все более важными. Однако отсутствие специфических клинических симптомов токсоплазмоза затрудняет диагностику, что подчеркивает необходимость разработки более эффективных методов обнаружения T. gondii.

Обнаружение Toxoplasma gondii gondii может быть достигнуто с помощью различных методов, включая этиологические, иммунологические и молекулярные методы. Этиологические методы, такие как мазки перитонеальной жидкости и окрашивание гистологических срезов, требуют много времени и имеют высокий уровень ложноотрицательных результатов. Иммунологические тесты, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), являются наиболее распространенными методами выявления токсоплазмоза. Хотя ИФА является простым и быстрым, пациенты в периоде «окна» инфекции могут быть пропущены, и существуют различные мешающие факторы, такие как ревматоидный фактор [7]. Кроме того, у пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ) и вторичной гипогаммаглобулинемией могут быть ложноотрицательные результаты из-за их неспособности вырабатывать антитела IgG [8]. В молекулярной биологии наибольшее распространение получила технология ПЦР. Бург и др. в двадцатом веке успешно использовали технологию ПЦР для обнаружения ДНК T. gondii в крови, используя ген B1 в качестве целевого гена [9]. Использование консервативных генов, таких как ген P30 и ген SAG1, позволило успешно обнаружить T. gondii [10, 11]. Количественная ПЦР (Q-ПЦР) — это полезная производная ПЦР, которую можно использовать как для качественного, так и для количественного анализа. Однако Q-PCR требует дорогих и точных инструментов, что ограничивает его использование лабораторией и делает его непригодным для полевых исследований.