Новости

May 17, 2024

Обратная транскрипция

Scientific Reports, том 13, номер статьи: 11470 (2023) Цитировать эту статью 9845 Доступов 4 Подробности об альтметрических метриках Процедура, показанная в этой статье, представляет собой новый метод транскриптома.

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 11470 (2023) Цитировать эту статью

9845 Доступов

4 Альтметрика

Подробности о метриках

Процедура, проиллюстрированная в этой статье, представляет собой новый метод анализа транскриптома с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции), который позволяет избежать необходимости устранения потенциального загрязнения ДНК. По сравнению с существующими методологиями наш метод является более точным, простым и воспроизводимым, поскольку он сохраняет целостность РНК, не требует материалов и/или реагентов, которые используются для удаления ДНК, а также уменьшает количество образцов, которые необходимо установить. в качестве отрицательного контроля. Эта новая процедура предполагает использование специально модифицированного праймера на этапе обратной транскрипции, который содержит несовпадающие основания, в результате чего образуются молекулы кДНК, отличающиеся от геномной ДНК. При использовании того же модифицированного праймера при амплификации ПЦР амплифицируется только матрица кДНК, поскольку матрица геномной ДНК частично гетерологична праймеру. Таким образом, на амплификацию с помощью ПЦР не влияет любое потенциальное загрязнение ДНК, поскольку она специфична только для матрицы кДНК. Кроме того, он точно отражает исходную концентрацию РНК в образце, которая подвержена изменениям из-за различных физических или ферментативных обработок, обычно используемых в современных методологиях удаления ДНК. Этот метод особенно подходит для количественного определения высокоповторяющихся транскриптов ДНК, таких как сателлитная ДНК.

Качественный и/или количественный анализ транскриптов методом ПЦР-амплификации является методом выбора как в молекулярно-биологических исследованиях, так и в медицинской диагностике1. Он широко используется для обнаружения и количественной оценки многих различных типов транскриптов, таких как информационная РНК, рибосомальная РНК, некодирующая РНК и т. д. Наиболее распространенные приложения включают анализ экспрессии генов и точную идентификацию конкретного микроорганизма.

Для правильного анализа очищенная РНК подвергается предварительному и фундаментальному этапу обратной транскрипции, посредством которого молекулы РНК преобразуются в кДНК (комплементарную ДНК) с помощью фермента обратной транскриптазы. Действительно, сама РНК не может быть напрямую амплифицирована на последующих этапах ПЦР и обязательно должна быть преобразована в кДНК1. Основная проблема большинства используемых в настоящее время протоколов заключается в часто присутствующем загрязнении ДНК, которое невозможно химически дифференцировать на структурном уровне от кДНК ферментом полимеразой во время ПЦР-амплификации, что приводит к ложноположительным результатам2,3,4,5, 6,7. Чтобы преодолеть это ограничение, все текущие протоколы включают несколько этапов удаления ДНК, как во время очистки РНК, так и на последующем этапе обратной транскрипции. В обоих случаях ДНК будет удалена либо с помощью специальных механических фильтров (колонки на основе кремнезема), либо посредством ферментативного расщепления специальным ферментом, таким как ДНКаза I (дезоксирибонуклеаза I)8. Однако эти методы лечения не на 100% эффективны для удаления ДНК, которая часто остается в виде загрязнения ДНК2,3. Это особенно справедливо для ДНК с большим количеством повторов, которая составляет значительную часть генома эукариот и часто транскрибируется на низких уровнях. Кроме того, следует подчеркнуть, что любая процедура, применяемая для снижения концентрации ДНК в образце, безусловно, приводит к снижению исходной концентрации самой РНК — молекулы, которая по своей природе нестабильна и легко разлагается.

Здесь мы сообщаем о новом методе анализа транскриптома с помощью ПЦР, в котором кДНК и ДНК дифференцируются и, таким образом, исключается контаминация последней, что дает более точные, надежные и воспроизводимые результаты.

Прямые, обратные и модифицированные праймеры, использованные для тестирования нового протокола, представлены в таблице 1. Модифицированный специфический праймер отличается от немодифицированных прямого и обратного праймеров всего четырьмя изменениями оснований (точечными мутациями), распределенными попеременно с неизмененными нуклеотидами и начиная с 3'-конец праймера (выделен жирным шрифтом в Таблице 1).